PCR引物设计时有哪些注意事项？【普通pcr引物设计网站 pcr为什么要两种引物】引物设计参数：a引物长度一般在20bp左右，上下游引物碱基长度不要相差超过4个碱基。b引物退火温度一般在58度，不同软件TM使用不同的算法，primer3，primer5，primer6，primerexpress等一般可以设置在55-58度，beacondesign可以设置在65左右。cGC含量一般没什么特殊要求，40-60最好，如果不好设计，30-80也是可以的。d产物长度在100-150，80-200也可以，不要在50bp左右，那样和引物二聚体不易区分，超过200bp可能会影响PCR扩增效率。e软件给出的引物不能有发卡结构和超过3-4个碱基的匹配，特别是3`端不能有碱基匹配，那样更容易形成二聚体。f引物设计好以后，在NCBI上做一个primer-blast，检测一下是否有非特异性扩增。

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