hiv病毒在人体内逆转录过程( 三 ) _逆转录

在两步法中，有三种不同的方法可用于引发cDNA反应：oligo(dT) 引物、随机引物、或序列特异性引物（图2，表2）。通常情况下，是将 oligo(dT) 引物和随机引物进行混合使用。这些引物退火至模板 mRNA 链，并提供给逆转录酶一个用于合成的起点位置。
逆转录酶是利用 RNA 合成 DNA 的一种酶。一部分逆转录酶具有 RNA 酶活性，能够在转录后降解 RNA-DNA 杂交链中的 RNA 链。如果其不具有 Rnase 酶活性，可加入 RNaseH 以获得更高的 qPCR 效率。常用的酶包括莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（MMLV）和禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶（AMV）。对于 RT-qPCR 来说，理想的情况下是选择具有较高热稳定性的逆转录酶，这样 cDNA 的合成能够在较高的温度下进行，确保成功转录具有较高二级结构的 RNA，同时保持其在整个反应过程中的全部活性，从而得到更高的 cDNA 产量。
RNase H 能够从 RNA-DNA 双链中降解 RNA 链，从而允许双链 DNA 的有效合成。然而，当使用长 mRNA 作为模板，RNA 可能被过早的降解，从而导致截短的 cDNA 。因此，在 cDNA 克隆过程中，如果需要合成长的转录物时，尽量减小 RNase H 的活性通常是有益的。与此相反，拥有 RNase H 活性的逆转录酶通常有利于 qPCR 的应用，因为它们能够在 PCR 的第一个循环中提高 RNA-DNA 双链的熔解（图3）。
用于 RT-qPCR 中 qPCR 步骤的 PCR 引物最好应设计成跨越一个外显子-外显子连接，其中一条扩增引物可以潜在地跨越实际外显子-内含子边界（图4）。由于含内含子的基因组 DNA 序列不会被扩增，因此这种设计可以减少从污染的基因组DNA中扩增得到的假阳性的风险。
如果引物不能被设计成能够分离外显子或外显子-外显子边界，则有必要利用无 RNA 酶的 DNA 酶I或 dsDNA 酶处理 RNA 样品以除去基因组 DNA 污染。
一个逆转录阴性对照（-RT对照）应该包括在所有的 RT-qPCR 的实验中，以检测 DNA 污染（如基因组 DNA 或来自之前反应的 PCR 产物）。这一对照包含除逆转录酶之外的所有反应组分。由于该对照不会发生逆转录，因此如果观察到 PCR 扩增，则极有可能来自 DNA 的污染。
【hiv病毒在人体内逆转录过程】