文章插图
差速离心法(离心法):交替使用低速和高速离心,用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法 。此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离 。
梯度离心法(浓度梯度):细胞内的物质具有一定的浓度,把细胞放入清水中,细胞吸水涨破 。除去细胞内的其他物质,得到细胞膜 。
密度梯度区带离心法(简称区带离心法),是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡,在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上,形成不同区带的分离方法 。此法的优点是:①分离效果好,可一次获得较纯颗粒;②适应范围广,能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒,又能分离有一定浮力密度差的颗粒;③颗粒不会挤压变形,能保持颗粒活性,并防止已形成的区带由于对流而引起混合 。此法的缺点是:①离心时间较长;②需要制备惰性梯度介质溶液;③操作严格,不易掌握 。
蔗糖密度梯度离心 。
用蔗糖密度梯度离心法进行了禽脑脊髓炎病毒的纯化 , 为了研究高等植物细胞质膜上的质子泵ATP酶的作用机理 , 需要纯化细胞质膜,Hodges等首先使用蔗糖梯度法纯化燕麦根细胞质膜,广泛地应用着 。
Lundborg等应用水溶性多聚体(PEG/Dextran)两相分配法纯化小麦根细胞质膜后,两相分配法在质膜纯化上逐步引人注意,被认为是一种优于蔗糖梯度法的方法,Lundborg等用两相分配法分 。
蔗糖密度梯度离心,将禽脑脊髓炎病毒(AEV)L2Z株、Van Roekel株和1143株分别经卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚,接毒后,以4500r/min离心及胰腺,用玻璃匀浆器制成10%的组织悬液 。组织悬液经3次反复冻融后,以4500r/min离心15min,取上清液 。
而后用氯仿处理 , 取水相 , 经冷冻真空浓缩 , 进行不连续蔗糖密度梯度离心 。取出含AEV的组分,用PBS稀后超速离心除去蔗糖 。亦称平衡密度梯度离心法 。
纯化病毒常用的方法是蔗糖密度梯度离心法,能得到比较纯的病毒 。其过程如下:
1、将收集的组织或脏器或其他 , 用玻璃匀浆器充分研磨后制成悬液,经反复冻融3次后,置-20 ℃冰箱中,备用 。
2、先以5000g离心15分钟后 , 获取上清夜,然后再20000g高速离心30分钟后取上清液 。
3、接着10万g超速离心2h , 将沉淀用少量STE溶解 。
4、先在超速离心管中加入5-8mL的第3步所获取的含病毒样品的溶解液 , 然后在离心管中依次加入30% , 45% , 60%的蔗糖 , 加的时候是用长针头从底部往上加的 。11万g离心25h,发现在30%与45%以及45%与60%之间都有一条明亮的带,用长针头将两条不同部位的带都吸取出来,分别收集到不同的瓶内 。
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