(2)等密度区带离心法:离心管中预先放置好梯度介质,样品加在梯度液面上,或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管,通过离心形成梯度 , 这就是预形成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式 。
离心时,样品的不同颗粒向上浮起,一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上 , 形成几条不同的区带 , 这就是等密度离心法 。体系到达平衡状态后 , 再延长离心时间和提高转速已无意义,处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置均不再受离心时间所影响 , 提高转速可以缩短达到平衡的时间,离心所需时间以最小颗粒到达等密度点(即平衡点)的时间为基准,有时长达数日 。
等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差 , 密度差越大,分离效果越好,与颗粒大小和形状无关,但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度 。
等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝CSCl,其密度可达17 g/cm3 。此法可分离核酸、亚细胞器等,也可以分离复合蛋白质,但简单蛋白质不适用 。
收集区带的方法有许多种 , 例如:
(1) 用注射器和滴管由离心管上部吸出 。
(2) 有针刺穿离心管底部滴出 。
(3) 用针刺穿离心管区带部份的管壁,把样品区带抽出 。
(4)用一根细管插入离心管底,泵入超过梯度介质最大密度的取代液,将样品和梯度介质压出 , 用自动部分收集器收集 。
主要有差速离心和密度梯度离心 :一般是先用差速离心初分离,再用密度梯度离心进一步分离 。
以下详细:
细胞器的分离
细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成 , 细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架等,这些也称作亚细胞组分 。对于细胞的结构和功能的研究,是细胞生物学的基本课题 , 其重要的研究手段之一是分离纯的亚细胞组分,观察它们的结构或进行生化分析 。分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心 。
一、差速离心(differentialcentrifugation)
在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心,用于分离不同大小的细胞和细胞器 。
速度逐渐提高,样品按大小先后沉淀
在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为:核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体 。
由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠 , 而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中,一般重复2~3次效果会好一些 。
差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞 , 更多用于分离细胞器 。对于精细的分离,则是密度梯度离心效果更好 。
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