高效液相色谱分析|高效液相色谱基本原理

高效液相色谱分析（高效液相色谱基本原理）原创叮当学术2020-01-19 20:37:34

文 / 利刃君
全文共3470字，建议阅读时间13分钟。
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）是色谱法的一个重要分支，应用范围十分广泛，对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，几乎所有的化合物包括高沸点、极性、离子型化合物和大分子物质均可用高效液相色谱法分析测定，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20% ，而80%则需用高效液相色谱来分析。HPLC具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度好、能分析和分离高沸点且不能气化的热不稳定生理活性物质的特点，已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。

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基本原理色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationphase)发生作用(吸附、分配、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。
高效液相色谱法以经典的液相色谱为基础，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有颗粒极细的高效固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

图1.高效液相色百思特网谱仪分析流程
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系统组成HPLC 系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。此外，还可根据需要配置梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC 仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC 仪还备有自动馏分收集装置。

图2.高效液相色谱仪的系统组成
1.输液系统输液泵是HPLC 系统中最重要的部件之一。输液泵按照输出液恒定的因素分为恒压泵和恒流泵，泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。
输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。

表1.几种高压性能泵的性能比较
HPLC使用的输液泵应满足下列条件：
①流量稳定，其RSD 应＜0.5% ，这对定性定量的准确性至关重要；
②流量范围宽，分析型应在0.1~10ml/min 范围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min；③输出压力高，一般应能达到150~300kg/cm2百思特网；
④液缸容积小；
⑤密封性能好，耐腐蚀。
（1）往复式柱塞泵
活塞向外移动时，泵头出口单向阀关闭，同时流动相进入的入口单向阀打开，溶液（流动相）抽入活塞缸。当柱塞推入缸体时，入口单向阀关闭，出口单向阀打开，流动相被压出活塞缸，流向色谱柱。双活塞往复泵的输液流量比单活塞泵小得多。其优点是不必使用消除脉冲的阻尼器，避免了阻尼器的压力消耗，但缺点是设备成本较高，流量调节也比单活塞泵复杂。往复式柱塞泵的特点是不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响，连续供给恒定体积的流动相。

图3.单活塞往复式柱塞泵的构造（A）和双活塞往复式柱塞泵构造（a）及排液特性（b）
（2）隔膜型往复泵
隔膜型往复泵也是一种恒流泵，活塞与油接触，当活塞往复运动时，隔膜受到油压的作用，对流动相部分产生"吸引"或"推压" ，使流动相部分的单向阀吸液或排液，从而获得稳定的液流。隔膜泵的活塞不直接与流动相接触，故不存在活塞密封垫磨损对流动相的污染。隔膜泵的死体积小（约0.1mL），因此，更换流动相后平衡快，有利于梯度洗脱。但隔膜泵结构比较复杂，价格较贵。