高效液相色谱分析|高效液相色谱基本原理( 二 ) 「问人人知识网」

图4.隔膜型往复泵结构示意图
（3）气动放大泵
气动放大泵是一种恒压泵。泵头通常由两部分组成--单向阀和密封圈-柱塞杆。单向阀一般由阀体\塑料\或陶瓷阀座和红宝石球组成，在压力的作用下宝石球离开阀座，流动相流过单向阀；反之，在反向力的作用下，宝石球回到阀座上，此时流动相不再流过单向阀。
2.脱气装置流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱，排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。
目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。
超声波振荡脱气：将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气10-20min 。这种方法比较简便，又基本上能满足日常分析操作的要求，所以，目前仍广泛采用。
惰性气体鼓泡吹扫脱气：将气源（钢瓶）中的气体（氦气）缓慢而均匀地通入储液罐中的流动相中，氦气分子将其它气体分子置换和顶替出去，而它本身在溶剂中的溶解度又很小，微量氦气所形成的小气泡对检测无影响。
真空脱气装置：将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱百思特网除。

图5.真空在线脱气装置示意图
3.梯度洗脱装置HPLC 有等强度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱两种方式。等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH 值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。
线性梯度：在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度。
阶梯梯度：直接从某一低强度的流动相改变为另一较高强度的流动相。
梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度（外梯度）和高压梯度（内梯度）。
高压梯度一般只用于二元梯度，即用两个高压泵分别按设定的比例输送A和B两种流动相至混合器。具有精度高，易于实现自动化控制的优点。

图6.高压梯度装置结构示意图
低压梯度只需一个高压泵，与等度洗脱输液系统相比，就是在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。在常压下混合往往容易形成气泡，所以低压梯度通常配置在线脱气装置。

图7.四元低压系统结构示意图
4.进样系统早期使用隔膜和停流进样器，装在色谱柱入口处。现在大都使用六通进样阀或自动进样器。进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。
一般HPLC 分析常用六通进样阀，六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。
①部分装液法进样：进样量应不大于定量环体积的50%（最多75％），并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注射器取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。
②完全装液法进样：进样量应不小于定量环体积的5~10 倍（最少3倍），这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。